超分辨率(SR)光学显微镜在超过衍射极限的空间分辨率下观察微观结构方面发挥着关键作用。通常，采用高数值孔径物镜来实现最佳的空间分辨率，尽管这通常涉及视野的妥协。在当前的超分辨率显微镜技术领域，人们对推进高通量方法的兴趣日益浓厚，强调大视场、快速度和高能效。当检测具有膨胀微观结构(如组织和肌动蛋白)的样品时，高通量技术特别有益，有助于更全面地揭示样品信息。此外，在动态观测中，高通量方法可以为研究人员提供更多的便利。超分辨率显微镜的最新进展已经成功地将高通量能力与高分辨率集成在一起。例子包括高通量受激发射耗尽显微镜、单分子定位显微镜(SMLM)和结构照明显微镜(SIM)。其中，SIM作为一种非扫描成像技术脱颖而出，不需要高强度照明激光或专门的荧光染料。因此，它具有大视场、高成像速度和最小的样品损伤，特别是在活细胞成像中。

高通量已成为超分辨显微镜领域的一个重要研究方向，特别是在提高动态观测能力方面。在这项研究中，本文提出了一种具有大视场(FOV)、快速成像速度和高功率效率的六边形晶格结构照明显微镜(hexSIM)系统。该方法采用空间光干涉产生二维六边形SIM图，并利用电光调制器进行高速移相。当使用100×/1.49的物镜时，该设计能够实现210µm直径的SIM照明FOV，以令人印象深刻的98帧/秒(fps)单帧速率捕获2048×2048像素的图像。值得注意的是，这种方法实现了接近100%的全视场和功率效率，eom控制SIM模式的相位，从而确保高速和精确的相移，使CMOS相机的读出时间成为成像速度的唯一限制因素。

本文还提出了一种新的基于互相关的EOM半波电压校准方法，消除了对迈克尔逊干涉仪的需要，并确保了相移的高精度。该系统采用紧凑的设计，垂直将光路分为两层，从而产生380×340mm²的适度占地面积，这种设置最大限度地减少了光能损失，提高了功率效率，并允许使用低功率激光器。此外，与2D-SIM的传统正弦照明模式相比，六边形点阵照明消除了改变照明方向的必要性。HexSIM重构只需要7张不同相位的原始图像。同时通过荧光纳米粒子和多色生物样品的实验验证了该系统的性能。

图1 (a)利用空间光干涉形成六边形晶格图案的方案，并安装一个消色差透镜将六边形晶格图案成像到CMOS相机上 (b)三束光的位置分布(绿点)和偏振方向

(c)放置直角棱镜反射器的底座结构 (d) CMOS相机拍摄的六边形晶格图

(e)沿着(a)黄线的强度分布图，突出显示用于计算调制深度的值

图2 基于空间光干涉的六边形格子全视场SIM系统实验建立

(a) SIM系统结构三维效果图(侧视图) (b)实物系统的照片 (c)系统下层光学装置示意图

（BC，光束准直器;HWP1-HWP7，半波片;PBS1-PBS2，极化分束器;M1-M7，反射镜;EOM1-EOM2，电光调制器;OPCD，光路补偿装置;rapm，直角棱镜反射器）

(d)系统上层光学装置示意图（M8-M11，反射镜;L1，消色差双透镜;TL1-TL2，管镜头）

(e)物镜背面焦平面上的三个聚焦斑分布在半径为2.5 mm的圆(红圈)的圆周上

图3 相位差计算流程图

(a) CMOS捕获的条纹图像 (b)频域过程 (c)每幅图像的相对相位和相电压拟合线

图4 100 nm荧光纳米颗粒的宽视场和六边形晶格SIM成像。

(a)荧光纳米颗粒的宽视场图像 (b)荧光纳米颗粒的六方晶格SIM重构图像

(c)宽视场图像(红色)和SIM图像(蓝色)中20个纳米颗粒的测量强度分布图 (d)宽视场图像(红色)和SIM图像(蓝色)中20个纳米粒子的FWHM统计 (e) (a)(红色)和(b)(蓝色)中感兴趣区域沿两条黄线的强度分布图

图5 huFIB细胞微管的宽视场六边形晶格SIM成像

(a) huFIB细胞微管的宽视场图像 (b) huFIB细胞微管的六边形晶格SIM重构图像 (c) (a)(红色)和(b)(蓝色)中感兴趣区域沿两条黄线的强度分布图

(d)基于去相关的宽视场图像分辨率分析;(e)基于去相关的六边形栅格SIM图像分辨率分析

图6 huFIB细胞肌动蛋白的宽视场六边形晶格SIM成像

(a)huFIB细胞肌动蛋白宽视场图像 (b) huFIB细胞Actin的六边形晶格SIM重构图像

(c) (a)(红色)和(b)(蓝色)中感兴趣区域沿两条黄线的强度分布图

(d)基于去相关的宽视场图像分辨率分析 (e)基于去相关的六边形栅格SIM图像分辨率分析

文献来源：Cheng Ji, Yukun Zhu, Enxing He, Qingqing Liu, Dakai Zhou, Shunyu Xie, Hanmeng Wu, Jinfeng Zhang, Kuangwei Du, Youhua Chen, Wenjie Liu, and Cuifang Kuang, "Full field-of-view hexagonal lattice structured illumination microscopy based on the phase shift of electro–optic modulators," Opt. Express 32, 1635-1649 (2024)

https://opg.optica.org/oe/fulltext.cfm?uri=oe-32-2-1635&id=545293